Popis znaků a markerů

Morfo-metrické znaky

Jde o základní popisné znaky podle kterých lze charakterizovat odrůdy bramboru pro naplnění testů DUS (distinctness, uniformity, stability) při registraci nových odrůd. V databázi KOB je použit systém protokolu DUS testů organizace CPVO EU (Community Plant Variety Office), který vychází ze systému organizace UPOV a který je také používán ÚKZÚZ při popisu odrůd bramboru. Popisný systém vychází z rozpoznávacích znaků lokalizovaných na rostlině či na jednotlivých orgánech rostliny bramboru. Lze je rozdělit do deseti skupin na znaky: klíčku, rostliny, stonku, listu, druhého páru bočních lístků, terminálního lístku a bočních lístků, květního pupenu, květenství, květní koruny a hlízy.

Profily nativních bílkovin (dle UPOV)

Pataniny

Jedná se o systém nativních bílkovin, získaných z pletiv hlíz po jejich mrazové destrukci, které jsou separovány na diskontinuální PAGE a vizualizovány barvením pomocí Coomassie Blue. Pataniny jsou vysoce polymorfní bílkoviny, jejichž pruhy (zóny) jsou po detekci na gelové matrici definovány hodnotami relativní elektroforetické mobility (REM) v rozpětí 33 – 60 (vyjádřeno v procentech). Počet alelových kombinací je velmi vysoký (až 80) a tyto kombinace jsou využity pro vytváření základních skupin (UPOV 2002; Bárta & Bártová 2007; Sýkorová 2008). Pataniny jsou identické s bílkovinnými pruhy A, B, C, D, které ve spektru nativních hlízových bílkovin nalezli Stegemann & Löschke (1976). Vytvářejí osm základních skupin (a dvě doplňkové skupiny) a jejich variabilita je založena na majoritních pruzích označených písmeny A, B, C, D. Variabilitu uvnitř skupiny, rozčleněnou na typy, tvoří intenzita majoritních pruhů a pozice ostatních pruhů v profilech. Bílkovinný polymorfismus představuje přítomnost či absenci jednotlivých pruhů v pozici (je vyjádřena relativní elektroforetickou mobilitou), případně jejich intenzitou (je dána tzv. genovou dávkou, tj. počtem aktivních alel v tetraploidní sestavě genotypů bramboru) (UPOV 2002; Sýkorová & Bradová 2007; Bárta & Bártová 2007; Bárta 2009).

Esterázy

Isoenzymy hlízových esteráz jsou podobně jako pataniny rovněž doporučovány metodikou UPOV pro charakterizaci odrůd bramboru (UPOV 2002; Sýkorová et al. 2006a). Esterázové isoenzymy bramborových hlíz jsou vysoce polymorfní a pravděpodobně se jedná o polymorfismus spojený s hlavní bílkovinou hlíz patatinem, jenž vykazuje aktivitu nespecifické lipidacylhydrolázy a existuje v několika nábojových isoformách (Dennis & Galliard 1974; Racusen 1984; Höfgen et al. 1990; Pots 1999; Bárta & Bártová 2007; Bárta 2009). Pruhy detekované na gelové matrici jsou u systému esteráz rozděleny do čtyř bloků (Est 1 – Est 4). Pro hodnocení jsou využívány bloky pruhů Est 2 a Est 3, naopak bloky pruhů Est 1 a Est 4 nejsou pro slabou enzymovou aktivitu používány. Systém hodnocení je založen nejen na počtu pruhů v určité pozici vyjádřené REM, ale také šířkou resp. intenzitou pruhů. Ta může být u hodnocených genotypů často výrazně odlišná díky tetraploidnímu založení bramboru a projevu „genové“ dávky (UPOV 2002; Sýkorová et al. 2006a; Bárta & Bártová 2007; Bárta 2009).

Peroxidázy

Polymorfismus isoenzymů peroxidáz je rovněž doporučován organizací UPOV pro charakterizaci genotypů bramboru. Není však tak výrazný jako polymorfismus esteráz a bílkovin. Isoenzymy peroxidáz jsou monomerní enzymy. Po elektroforetické separaci na gelu jsou většinou patrné dvě skupiny pruhů. Horní řada výrazných pruhů s hodnotami relativní elektroforetické mobility 59 a 68 je používána pro rozpoznávání genotypů. Méně výrazné pruhy s vyššími hodnotami REM podle systému UPOV nejsou využívány. Rozdíly mezi genotypy jsou vyjádřeny počtem pruhů, jejich pozicí vyjádřenou REM a také genovou dávkou (UPOV 2002; Sýkorová et al. 2006b; Bárta & Bártová 2007).

Profily denaturovaných bílkovin (doplňkový systém)

Spektrum denaturovaných bílkovin hlíz brambor je tvořeno dvěma skupinami majoritních bílkovin – komplexem patatinových bílkovin a inhibitory proteáz.  Pro využití variability denaturovaných bílkovin je potřebné použít separační techniku SDS-PAGE (Laemmli 1970; Pots 1999; Bárta 2002; Bárta 2009) na 10% separačních gelech. V rámci výsledků prezentovaných v této elektronické databázi byla při použití techniky SDS-PAGE hodnocena variabilita profilů denaturovaných bílkovin v oblasti s molekulovou hmotností 39 – 45 kDa (oblast patatinu) a v oblasti s molekulovou hmotností 4 – 25 kDa (oblast inhibitorů proteáz).

V oblasti patatinu (39 – 45 kDa) bylo v rámci hodnocených odrůd nalezeno od 1 do 4 pruhů. Navržený systém hodnocení využívá zjištěného počtu pruhů ve spektru pro roztřídění odrůd do čtyř skupin (1-4). Pro další charakterizaci odrůd byla využita intenzita pruhů a jejich postavení v inkriminované oblasti, čímž bylo možné odrůdy řadit do dalších podskupin označených písmeny – celkově tak v oblasti patatinu bylo nalezeno 12 elektroforetických fenotypů. V oblasti inhibitorů proteas (4 – 25 kDa) bylo postupováno obdobně, přičemž v této oblasti bylo v rámci souboru hodnocených odrůd nalezeno 5 – 8 pruhů, čímž vznikly čtyři skupiny (s označením podle počtu pruhů 5 – 8). Podrobnější specifikací charakteru spektra (intenzita, postavení) vzniklo uvnitř každé skupiny opět třídění na podskupiny označené písmeny – celkem tedy bylo v oblasti inhibitorů proteáz nalezeno 7 elektroforetických fenotypů. V důsledku velkého počtu registrovaných odrůd nelze použít variabilitu denaturovaných bílkovin pro jednoznačnou charakterizaci odrůd, ale lze ji využít jako doplňkový marker v kombinaci s ostatními systémy. Detailnější informace jsou uvedeny v práci Bártová et al. (2009).

Nově je možné denaturované bílkoviny separovat také pomocí elektroforetického systému na čipu. V této elektronické databázi KOB jsou prezentovány profily denaturovaných bílkovin po analýze na automatické čipové elektroforéze Experion od firmy Bio-rad (USA). Profil denaturovaných bílkovin hlíz bramboru lze pochopitelně opět rozdělit na dvě skupiny – oblast patatinových bílkovin a oblast inhibitorů proteáz. Nicméně výše uvedené intervaly molekulových hmotností obou skupin bílkovin jsou poněkud odlišné v důsledku „posunu“ molekulových hmotností a také kvůli omezenému rozsahu analytického rozpětí molekulové hmotnosti této techniky v intervalu 10 – 260 kDa. Již v předchozích pracích (Zhu et al. 2005; 2006), které se zabývaly hodnocením čipové elektroforézy Experion, bylo zjištěno, že hodnoty MW u analyzovaných bílkovin mohou být více či méně odlišné v pozitivním i negativním směru oproti deklarovaným hodnotám. Z uvedeného důvodu byla definice oblasti inhibitorů proteáz pro hodnocení posunuta ze 4 – 25 kDa na 9 – 36,5 kDa  a definice oblasti patatinových bílkovin byla posunuta z  39 – 45 kDa na 42 – 59 kDa. Pro vlastní hodnocení variability odrůd bramboru v obou klíčových oblastech by bylo možné využít několik parametrů, avšak pro daný účel lze pokládat za vhodné využití počtu detekovaných píků či pruhů a jejich pozice ve spektru pomocí hodnot migračního času či molekulové hmotnosti (zařazení do intervalu molekulové hmotnosti). Podrobnější informace jsou uvedeny v publikaci Bárta et al. (2009).

DNA markery: Mikrosatelity (Simple Sequence Repeat, SSR)

Účinnou a značně rozvíjenou technikou je v oblasti DNA markerů analýza mikrosatelitních sekvencí nebo též jednoduchých repetitivních sekvencí (Single Sequence Repeat). Mikrosatelity jsou tandemové repetice obvykle 2 – 4 parů bazí (např. GA, TCC a GATA) (HAMADA et al. 1982; MORGANTE & OLIVIERI 1993; POWELL et al. 1996), které jsou rovnoměrně rozptýleny v eukaryotickém geonomu (CREGAN 1992; MORGANTE & OLIVIERI 1993). Tyto sekvence s kodominantní dědičností se vyznačují hojností a polymorfismem, který spočívá ve variabilním počtu opakujících se motivů. Mikrosatelity mohou být analyzovány pomocí PCR s užitím specifických primerů, a proto se vyžaduje znalost sekvence DNA pro navržení primerů (RAMEL 1997). PCR produkt je vizualizován na agarozovém nebo polyakrylamidovém gelu elektroforézou. U brambor se SSR markery používají pro konstrukci genomických map, markerování znaků, fingerpriting, fylogenetické studie a k charakterizaci materiálů v genových bankách. Podrobnější informace (včetně metodického postupu) jsou uvedeny v práci ČURN et al. (2008).

Přehled uplatněných primerových párů pro analýzu SSR

označení primerového páru sekvence
STM 1052
5´– CAA TTT CGT TTT TTC ATG TGA CAC –3´
5´– ATG GCG TAA TTT GAT TTA ATA CGT AA –3´

5´– CAA TTT CGT TTT TTC ATG TGA CAC –3´

5´– ATG GCG TAA TTT GAT TTA ATA CGT AA –3´

STG BBS

5´– AAT CGG TGA TAA ATG TGA ATG C – 3´

5´– ATG CTT GCC ATG TGA TGT GT – 3´

STS 1+2

5´– TCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AAC –3´

5´– TCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGA –3´

STM 1102

5´– GGA AGA ATT TTG TAG GTT CAA – 3´

5´– AAA GTG AAA CTT CCT AGC ATG – 3´

STWIN 12G

5´– TGT TGA TTG TGG TGA TAA – 3´

5´– TGT TGG ACG TGA CTT GTA – 3´

STM 3015

5´- AGC AAT AAA GTC AAC ACT CCA TCA –3´

5´- AAT GAA TTA GGG GGA GGT GTG –3´

STM 2005

5´– TTT AAG TTC TCA GTT CTG CAG GG – 3´

5´– GTC ATA ACC TTT ACC ATT GCT GGG – 3´